目前，NOTES 手术的最佳入路尚未明确。NOTES手术入路选择需要考虑以下几个因素：①通道建立和关闭的难易程度；②是否会引起腹腔感染；③通道关闭失败后是否会引起严重并发症；④器械通过和标本取出需要的通道最大直径；⑤通道与目标脏器的解剖关系等。
(一)经阴道入路
经阴道入路是目前较为成熟的NOTES手术路径，绝大部分泌尿外科NOTES手术均经此入路完成。经阴道入路具有以下优势：①感染概率小，安全性高；②阴道后穹隆处组织较薄，容易进入腹腔，创伤小；③手术视野和空间定位较好；④适合刚性器械（如腹腔镜操作器械）操作；⑤阴道后穹隆切口扩大后适合较大标本取出；⑥术后切口容易闭合；⑦术后疼痛轻。但该入路仅限于已婚已育女性患者，且有盆腔手术史的患者应用该入路受限。另外，手术对女性生育功能的影响有待进一步研究。
(二)经结直肠入路
经结直肠入路具有类似经阴道入路的优点，适合较大标本的取出且不受性别的限制。然而该入路最大的难题在于如何可靠关闭通道并避免腹腔感染，这也限制了其临床应用。
(三)经膀胱入路
与经阴道、结直肠入路相比，经膀胱入路是下腹位置最靠前的手术路径。该入路的建立过程较安全，而且在保证尿液引流充分的情况下，<5mm的膀胱穿刺孔可不需要关闭。但由于人体尿道管腔小，手术操作空间狭小且容易造成尿道损伤及尿道狭窄等并发症，也不利于手术标本的取出。
(四)经胃入路
经胃入路适用于处理下腹部脏器的操作，如经胃阑尾切除术。但对于施行上腹部手术则难度较大且不适合于取出较大标本，如肾脏等。另外，胃切口关闭的困难是限制该入路在NOTES领域发展的另一重要因素。
(五)联合入路
两种入路的联合使用可克服单一入路的不足，从而达到顺利完成手术的目的。如联合经胃-膀胱、胃-阴道等入路实施手术。
